一、保護劑與賦形劑開發(fā)

1. 保護劑開發(fā)

保護劑是凍干過程中防止活性組分變性失活的關(guān)鍵成分，其選擇和優(yōu)化直接影響凍干制品的質(zhì)量。IVD試劑凍干保護劑開發(fā)需遵循以下原則：

n 針對性篩選：根據(jù)試劑類型（如核酸、酶類、抗原抗體）選擇合適的保護劑。

l 實驗方法：采用單因素篩選和正交試驗相結(jié)合的方式，確定最佳保護劑種類和濃度。例如，通過活菌計數(shù)法評估保護效果，計算公式為：存活率(%)＝(凍干后活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù))×100%

l 協(xié)同優(yōu)化：復合保護劑比單一成分效果更優(yōu)。雞重組α-干擾素凍干保護劑配方為甘露醇(3%)+PEG(3%)，凍干粉劑在40℃條件下貯藏12個月，生物活性無變化

2. 賦形劑開發(fā)

賦形劑主要作用是支撐凍干制品的物理結(jié)構(gòu)，使其具有良好的形態(tài)和機械強度，便于轉(zhuǎn)移和儲存  。

l 常用賦形劑：甘露醇、甘氨酸、乳糖、右旋糖苷等，其中甘露醇在核酸試劑中應用廣泛，濃度通常在65%-68%(W/W)時可形成大小形態(tài)均一、吸濕性低的凍干微珠

l 篩選標準：需同時滿足物理支撐（如凍干珠成型）和復溶效率要求，不影響復溶后的檢測性能

l 協(xié)同開發(fā)：賦形劑與保護劑需協(xié)同優(yōu)化。例如，重組豬抑制素蛋白凍干保護劑篩選中，可溶淀粉和β?環(huán)糊精的保護效果較好，表現(xiàn)為外形飽滿無坍縮、色澤細膩白亮、復溶后無沉淀、電泳檢測發(fā)現(xiàn)蛋白條帶無降解

二、凍干樣品測試

凍干樣品測試是評估凍干工藝效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要包括以下方面：

1. 復溶效率測試

復溶效率直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準確性和操作便利性，測試指標包括：

l 復溶時間：記錄凍干樣品溶解所需時間，如羥基酪醇納米脂質(zhì)體凍干粉要求在1分鐘內(nèi)復溶成均勻懸浮液且無不溶顆粒或團塊

l 復溶均勻性：通過目視觀察或儀器檢測樣品溶解后的均勻程度

l 再分散性：評估凍干制品在復溶后的分散狀態(tài)，如納米顆粒是否保持良好分散性

2. 活性保留率測試

活性保留率是評價凍干制品質(zhì)量的核心指標，測試方法因試劑類型而異：

l 核酸試劑：通過熒光定量PCR檢測凍干前后核酸擴增效率，如CT值變化、熒光增益值等

l 酶類試劑：采用特定底物反應法測定凍干前后酶活性，如β-葡萄糖苷酶活性測定采用DNS法

l 抗原抗體試劑：通過ELISA等方法檢測凍干前后抗體效價、特異性等指標的變化

3. 形態(tài)穩(wěn)定性測試

形態(tài)穩(wěn)定性影響凍干制品的物理性質(zhì)和儲存穩(wěn)定性：

l 凍干顯微鏡觀察：實時監(jiān)測凍干過程中樣品結(jié)構(gòu)變化，評估塌陷溫度

l 掃描電鏡(SEM)分析：觀察凍干制品微觀結(jié)構(gòu)，如凍干珠的表面形貌和孔隙結(jié)構(gòu)

l 機械強度測試：評估凍干制品的抗壓強度和脆碎度，如凍干珠需通過抗壓測試確保在分裝過程中不易碎裂

三、凍干曲線開發(fā)與關(guān)鍵溫度測試

1. 凍干曲線開發(fā)

凍干曲線是凍干過程的關(guān)鍵指導文件，包含預凍、一次干燥（升華干燥）和二次干燥（解析干燥）三個階段的溫度-時間關(guān)系  。

l 預凍階段：需根據(jù)共晶點確定溫度（通常低于共晶點5-10℃），并控制降溫速率（速凍或慢凍）。例如，5-氮雜胞苷-D-甘露醇溶液共晶點為-6.54℃，預凍溫度選定為-25℃

l 一次干燥（升華干燥）：溫度需低于共熔點（如-1.67℃），真空度控制在10-30 Pa，升溫速率通常為2℃/min。如尿促性素一次升華溫度為-12.5℃，維持70分鐘

l 二次干燥（解析干燥）：需緩慢升溫至更高溫度（如20-40℃），確保殘留水分去除。例如，硼替佐米二次升華階段溫度分別于5℃、20℃和40℃維持300分鐘、110分鐘和220分鐘

2. 關(guān)鍵溫度測試

凍干關(guān)鍵溫度測試是確定凍干曲線的基礎，主要包括以下參數(shù)：

l 共晶點測試：

n DSC熱分析法：通過差示掃描量熱儀測定，如5-氮雜胞苷-D-甘露醇溶液的共晶點為-6.54℃

n 電阻法：當物料冷凍溫度降至某一值，物料全部凍結(jié)，電阻突然增大，該溫度即為共晶點

l 共熔點測試：通過DSC測定，當溫度升至某一值時冰晶開始熔化，該溫度即為共熔點

l 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度測試：通過DSC測定，如GGT試劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為-18.75℃

l 塌陷溫度測試：

n 凍干顯微鏡法：實時觀察凍干過程中樣品結(jié)構(gòu)變化，當干燥層溫度上升到某一臨界值時，固體基質(zhì)的剛性不足以維持蜂窩狀結(jié)構(gòu)，空穴的固形物基質(zhì)壁發(fā)生塌陷，該臨界溫度即為塌陷溫度

n 介電分析法：通過介電性能的變化判定塌陷溫度

四、生產(chǎn)放大方案設計

從小批量到大批量的生產(chǎn)放大是IVD試劑凍干制品開發(fā)服務的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需考慮以下因素：

1. 小批量生產(chǎn)（實驗室級）

l 設備選擇：0.1㎡凍干面積的凍干機，適用于小規(guī)模研發(fā)和驗證

l 工藝驗證：通過壓力升測試、板溫均勻性驗證等方法確認凍干終點

l 樣品測試：重點測試凍干制品的活性保留率、復溶效率和形態(tài)穩(wěn)定性

2. 中批量生產(chǎn)（中試級）

l 設備升級：1㎡凍干面積的凍干機，適用于中等規(guī)模生產(chǎn)驗證

l 工藝參數(shù)調(diào)整：根據(jù)放大效應調(diào)整凍干曲線，如注射用尿促性素的凍干工藝參數(shù)優(yōu)化，將凍干周期由原來的22h縮短至18.5h

l 批次一致性驗證：通過多批次測試確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，如凍干珠的裝量差異控制在±3%以內(nèi)

3. 大批量生產(chǎn)（工業(yè)級）

l 設備選型：5㎡凍干面積的工業(yè)級凍干機，需滿足GMP合規(guī)要求，如冷阱溫度≤-60℃，極限真空度≥15 Pa，板溫均勻性良好

l 工藝優(yōu)化：采用數(shù)學模型（如凍干機熱轉(zhuǎn)移系數(shù)模型）指導工藝參數(shù)調(diào)整，減少放大實驗次數(shù)

l 質(zhì)量控制：建立全面的質(zhì)量控制體系，包括原液質(zhì)量控制、灌裝過程控制、凍干過程監(jiān)控和成品檢測等

五、IVD試劑凍干制品開發(fā)服務實施路徑

1. 項目啟動與需求分析

l 與客戶深入溝通，明確凍干制品的技術(shù)要求和質(zhì)量標準

l 分析IVD試劑特性，確定保護劑和賦形劑開發(fā)方向

l 制定項目計劃，明確各階段時間節(jié)點和交付物

2. 保護劑與賦形劑開發(fā)

l 根據(jù)IVD試劑類型（核酸、酶類、抗原抗體）設計保護劑篩選方案

l 采用單因素篩選和正交試驗確定最佳保護劑種類和濃度

l 通過響應面法優(yōu)化復合保護劑配方，提高活性保留率

l 篩選合適的賦形劑，確保凍干制品良好的物理形態(tài)和機械強度

3. 凍干樣品測試與關(guān)鍵溫度測定

l 使用凍干顯微鏡（如LyoStat5）進行凍干前分析，確定塌陷溫度、玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度等關(guān)鍵參數(shù)

l 通過DSC熱分析儀測定共晶點、共熔點和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度

l 制備凍干樣品，進行活性保留率、復溶效率和形態(tài)穩(wěn)定性測試

l 建立凍干制品的質(zhì)量評價體系，制定質(zhì)量標準

4. 凍干曲線開發(fā)與工藝優(yōu)化

l 基于關(guān)鍵溫度測試結(jié)果，設計初步凍干曲線

l 進行凍干實驗，通過壓力升測試、板溫均勻性驗證等方法確認凍干終點

l 優(yōu)化凍干曲線，平衡凍干效率和產(chǎn)品質(zhì)量

l 建立凍干過程監(jiān)控體系，確保工藝參數(shù)穩(wěn)定控制

5. 生產(chǎn)放大與規(guī)模轉(zhuǎn)化

l 從小試（0.1㎡凍干面積）到中試（1㎡凍干面積）再到量產(chǎn)（5㎡凍干面積）的逐步放大

l 根據(jù)放大效應調(diào)整凍干曲線，確保不同批量產(chǎn)品質(zhì)量一致

l 建立批次一致性驗證方案，進行多批次測試

l 完成凍干制品的穩(wěn)定性評估，包括實時穩(wěn)定性、加速穩(wěn)定性測試等

六、質(zhì)量控制與合規(guī)性保障

1. 質(zhì)量控制體系

l 建立完整的質(zhì)量控制流程，包括原液質(zhì)量控制、灌裝過程控制、凍干過程監(jiān)控和成品檢測

l 制定關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)清單，如活性保留率、復溶時間、水分含量等

l 建立關(guān)鍵工藝參數(shù)(CPPs)監(jiān)控體系，如預凍溫度、升華溫度、真空度等

2. 合規(guī)性保障

l 確保凍干設備符合GMP要求，如內(nèi)壁采用鏡面拋光處理（粗糙度Ra≤0.8μm），配備在線CIP（原位清洗）和SIP（原位滅菌）功能

l 凍干過程參數(shù)需符合FDA 21 CFR Part 11數(shù)據(jù)合規(guī)要求，支持凍干過程參數(shù)實時監(jiān)控、曲線存儲與數(shù)據(jù)追溯

l 完成凍干制品的穩(wěn)定性評估，包括實時穩(wěn)定性（效期開始前、效期中、效期末）和加速穩(wěn)定性測試

l 確保凍干制品符合目標市場法規(guī)要求，如歐盟IVDR、中國YY/T 1579-2017《體外診斷醫(yī)療器械體外診斷試劑穩(wěn)定性評價》等

七、凍干制品穩(wěn)定性評估與加速試驗

1. 穩(wěn)定性評估

l 實時穩(wěn)定性：在預期儲存條件下，定期檢測凍干制品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，如活性保留率、復溶時間、水分含量等

l 加速穩(wěn)定性：在較高溫度（如40℃）和濕度條件下，快速評估凍干制品的穩(wěn)定性

l 開瓶穩(wěn)定性：評估凍干制品開封后的穩(wěn)定性，如復溶穩(wěn)定性、多次凍融穩(wěn)定性等

l 運輸穩(wěn)定性：模擬實際運輸條件（如溫度波動、濕度變化、震動等），評估凍干制品的運輸穩(wěn)定性

2. 加速試驗與長期試驗關(guān)聯(lián)性

l 通過加速試驗快速篩選保護劑配方和凍干曲線，從中選出具有潛力的候選方案

l 采用穩(wěn)定性方程預測凍干制品的儲存周期，如某植物乳桿菌凍干樣品的儲存穩(wěn)定性方程為：LgK=-8650/T+25.522

l 根據(jù)加速試驗結(jié)果，設計長期穩(wěn)定性試驗方案，驗證凍干制品的實際貨架期